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瓊脂糖凝膠電(diàn)泳實驗常見問題分析

發布時(shí)間(jiān)：

2024-01-15 15:07

瓊脂糖凝膠電(diàn)泳實驗常見問題分析

瓊脂糖凝膠電(diàn)泳已經成為(wèi)一種分析鑒定重組DNA分子及蛋白質與核酸相互作(zuò)用的重要實驗手段，也是分子生(shēng)物學研究的重要方法，常用于DNA分型、鑒定DNA、RNA分子混合物、DNA核苷酸序列分析等技(jì)術(shù)，以瓊脂凝膠作(zuò)為(wèi)支持物，利用 DNA 分子在電(diàn)場(chǎng)中的電(diàn)荷效應和(hé)分子篩效應，達到分離混合物的目的。

現在我們一起了解一下瓊脂糖凝膠電(diàn)泳的工作(zuò)原理(lǐ)和(hé)實驗中常見的問題和(hé)解決方法。

  1. 什麽是電(diàn)泳？

電(diàn)泳是一種利用電(diàn)流根據DNA、RNA或蛋白質的物理(lǐ)特性（如大(dà)小(xiǎo)和(hé)電(diàn)荷）來(lái)分離它們的技(jì)術(shù)。

  1. 什麽是瓊脂糖？

瓊脂糖是一種線性多(duō)糖聚合物，從紅色海藻産物瓊脂中提取而來(lái)。将瓊脂糖粉末加熱到熔點後冷切凝固便會(huì)形成良好的電(diàn)泳介質，其密度由瓊脂糖的濃度決定。

  1. 什麽是瓊脂糖凝膠電(diàn)泳？

瓊脂糖凝膠電(diàn)泳是一種電(diàn)泳形式，用于根據核酸（DNA或RNA）片段的大(dà)小(xiǎo)進行(xíng)分離。當施加電(diàn)流時(shí)，帶負電(diàn)的DNA/RNA通(tōng)過瓊脂糖凝膠的孔隙向凝膠帶正電(diàn)的一端遷移，較小(xiǎo)的片段遷移較快。由此産生(shēng)的條帶可(kě)以用紫外線（UV）光來(lái)觀察。

  1.  瓊脂糖凝膠電(diàn)泳實驗技(jì)巧和(hé)注意事項
  • 瓊脂糖凝膠溶液配制(zhì)時(shí)總液體(tǐ)量不宜超過錐型瓶50%容量。否則會(huì)溢出。
  • 加熱過程中要不時(shí)搖動，使附于瓶壁上(shàng)的瓊脂糖顆粒進入溶液。加熱時(shí)應蓋上(shàng)封口膜，以減少(shǎo)水(shuǐ)份蒸發。
  • 注意不要損傷梳底部的凝膠。一個(gè)是在拔梳子的時(shí)候，一個(gè)是在加樣時(shí)。
  • 凝膠濃度越低(dī)（非常脆弱且難以處理(lǐ)），分辨的片段越大(dà)；凝膠濃度越高(gāo)（很(hěn)脆且可(kě)能凝固不均勻），分辨的片段越小(xiǎo)。所以在制(zhì)膠的時(shí)候要特别注意。
  1. 瓊脂糖凝膠電(diàn)泳常見問題與異常分析

Q1：為(wèi)什麽marker條帶非常模糊，無法辨别具體(tǐ)條帶？

A1：出現上(shàng)述情況，可(kě)能有(yǒu)以下幾個(gè)原因：

1. marker條帶出現了降解。請(qǐng)确保在使用過程中避免核酸酶污染；

2. 電(diàn)泳緩沖液陳舊(jiù)。電(diàn)泳緩沖液多(duō)次使用後，離子濃度降低(dī)，pH值上(shàng)升，緩沖能力減弱，從而影(yǐng)響電(diàn)泳效果，建議經常更換電(diàn)泳緩沖液；

3. 電(diàn)泳條件不合适。電(diàn)泳時(shí)電(diàn)壓應不超過20V/cm，溫度應低(dī)于30℃；

4. marker上(shàng)樣量過多(duō)。請(qǐng)根據說明(míng)書(shū)選用合适上(shàng)樣量；

5. 凝膠質量不好。建議使用質量較好的瓊脂糖；此外，凝膠凝固不均勻也會(huì)導緻條帶模糊。

Q2：為(wèi)什麽marker條帶出現不規則的條帶（如啞鈴狀等）？
A2：出現上(shàng)述情況，多(duō)與以下幾個(gè)原因有(yǒu)關：

1. 電(diàn)泳緩沖液陳舊(jiù)。老化的電(diàn)泳緩沖液離子濃度降低(dī)，pH值上(shàng)升，緩沖能力減弱，從而影(yǐng)響電(diàn)泳效果，建議經常更換電(diàn)泳緩沖液；

2. 電(diàn)泳條件不合适。電(diàn)泳時(shí)電(diàn)壓應不超過20V/cm，電(diàn)壓太高(gāo)可(kě)能也會(huì)導緻marker條帶出現不規則現象。此外，凝膠質量差以及凝膠冷卻時(shí)凝固不均勻也會(huì)導緻該現象出現。

Q3：為(wèi)什麽marker條帶非常弱或者根本沒有(yǒu)條帶？
A3：出現上(shàng)述情況可(kě)能是：

1. marker上(shàng)樣量較低(dī)，可(kě)适當增加上(shàng)樣量；

2. 凝膠質量較差或凝膠凝固不均勻也會(huì)導緻電(diàn)泳條帶弱或根本沒有(yǒu)條帶；

3. 電(diàn)泳時(shí)間(jiān)過長導緻marker條帶跑出凝膠，可(kě)縮短(duǎn)電(diàn)泳時(shí)間(jiān)，降低(dī)電(diàn)壓，增加凝膠濃度。
Q4：為(wèi)什麽marker缺帶？
A4：對于含有(yǒu)較小(xiǎo)片段的marker，如果出現缺帶現象，可(kě)能是因為(wèi)：

1. 小(xiǎo)條帶跑出凝膠或分子量大(dà)小(xiǎo)非常相近的條帶不易辨認所緻，可(kě)适當縮短(duǎn)電(diàn)泳時(shí)間(jiān)，降低(dī)電(diàn)壓，同時(shí)增加凝膠濃度；

2. 凝膠中染料含量過低(dī)，導緻大(dà)片段結合染料量太少(shǎo)或沒有(yǒu)，在藍(lán)光儀下亮度太低(dī)，可(kě)适當增加染料用量。

Q5：加樣孔出現熒光

1. 原因分析：大(dà)片段DNA的滞留；

2. 解決方法：樣品出現溢出，應該通(tōng)過降低(dī)模闆量或濃度來(lái)處理(lǐ)；

Q6：條帶模糊或彌散

1. 原因分析：

（1）DNA發生(shēng)降解；
（2）電(diàn)泳緩沖液陳舊(jiù)；

（3）電(diàn)泳條件不合适；

（4）核酸樣品純度差，含有(yǒu)DNA結合蛋白或高(gāo)濃度的鹽分；

（5）染色時(shí)間(jiān)過長或拍照前放置過久，DNA條帶彌散；

（6）PCR非特異性的擴增；

（7）加樣時(shí)操作(zuò)不當，樣品飄出樣孔；

2. 解決方法：

（1）更換緩沖液；

（2）根據凝膠大(dà)小(xiǎo)和(hé)電(diàn)泳緩沖液類型，使用适當的電(diàn)壓進行(xíng)電(diàn)泳；

（4）電(diàn)泳結束後及時(shí)觀察、拍照； 

（5）DNA Maker進行(xíng)對照，校(xiào)正是否為(wèi)電(diàn)泳體(tǐ)系的問題；

（6）使用特異性較高(gāo)的引物；

（7）降低(dī)電(diàn)泳時(shí)的上(shàng)樣量，并小(xiǎo)心謹慎操作(zuò)實驗；

                                                                                                                                                      

Q7：無條帶或者弱條帶

  1. 原因分析：

（1）DNA的上(shàng)樣量不夠；

（2）DNA發生(shēng)降解；

2. 解決方法：

（1）增加上(shàng)樣量；

（2）防止DNA降解，如：避免反複凍融樣品、避免核酸酶的污染。

         

Q8：DNA Marker降解

  1. 原因分析：
  1. 核酸酶污染；
  2. 保存不當；
  1. 解決方法：
  1. 每次吸取時(shí)更換滅菌槍頭，勿将電(diàn)泳緩沖液帶入管中、用後密閉4°C保存；

（2）4°C 或-20°C保存，避免多(duō)次反複凍融、不可(kě)加熱；

Q9：DNA Marker無正确分離

  1. 原因分析：
  1. 瓊脂糖質量差；        
  2. 電(diàn)泳緩沖液多(duō)次使用後失效；
  1. 解決方法：
  1. 使用質量可(kě)靠的瓊脂糖制(zhì)膠；
  2. 更換緩沖液；

Q10：條帶缺失

  1. 原因分析：
  1. DNA條帶分子量過大(dà)；
  2. 分子量接近的DNA條帶沒有(yǒu)分開(kāi)；
  3. 電(diàn)泳緩沖液使用不當；
  4. 電(diàn)泳時(shí)間(jiān)過長或電(diàn)壓過高(gāo)，DNA走出凝膠
  5. 電(diàn)極插反，DNA走出凝膠
  1. 解決方法：
    （1）使用脈沖凝膠電(diàn)泳； 

（2）選擇适當的凝膠濃度進行(xíng)電(diàn)泳；    

（3）SD和(hé)TBE緩沖液适于分析較小(xiǎo)分子量的核酸片段，大(dà)片段分子不能完全分離；TAE緩沖液不适于分離很(hěn)小(xiǎo)的核酸片段；   

（4）縮短(duǎn)電(diàn)泳時(shí)間(jiān)，調整電(diàn)壓；   

（5）正确連接電(diàn)極方向；

Q11：條帶大(dà)小(xiǎo)不正确

  1. 原因分析：
  1. 核酸降解或形成聚合物；  

（2）λ DNA酶切Marker的cos位點複性；

（3）相同分子量的核酸片段由于結構或序列的差異而有(yǒu)不同的遷移率；

（4）梳子變形，點樣孔不在同一水(shuǐ)平線上(shàng)；

2. 解決方法：
（1）加熱處理(lǐ)或重新制(zhì)備樣品；   

（2）電(diàn)泳前65°C加熱5分鍾，冰上(shàng)冷卻5分鍾以後再上(shàng)樣；   

（3）判斷核酸分子是否有(yǒu)特殊結構，如缺口、超螺旋、二聚體(tǐ)等；富含AT堿基的DNA遷移率比同分子量富含GC堿基的核酸片段慢；   

（4）使用完好的梳子制(zhì)膠。

Q12：小(xiǎo)片段擴散，條帶模糊，粗

  1. 原因分析：
  1. 錯誤選擇了低(dī)濃度凝膠，觀察大(dà)片段用低(dī)濃度凝膠,觀察小(xiǎo)片段要用高(gāo)濃度；
  2. 瓊脂糖質量不好，質量不好的瓊脂糖分離小(xiǎo)片段容易擴散,即使是使用高(gāo)濃度凝膠；
  3. 選擇了不合适的電(diàn)泳緩沖液 ； 
  1. 解決方法：
  1. 比如觀察100bp的小(xiǎo)片段用2%凝膠跑電(diàn)泳；    
  2. 換用質量好的瓊脂糖；    
  3. SD和(hé)TBE緩沖液适于分析較小(xiǎo)分子量的核酸片段，大(dà)片段分子不能完全分離；TAE緩沖液不适于分離很(hěn)小(xiǎo)的核酸片段。

Q13：條帶偏移扭曲

  1. 原因分析：
  1. 瓊脂糖凝膠配置出現問題；
  2. 凝膠未完全凝固；
  3. 凝膠在電(diàn)泳槽中位置擺放偏移；
  1. 解決辦法：
  1. 應準确配置瓊脂糖凝膠，并充分進行(xíng)凝固；
  2. 應固定好凝膠在電(diàn)泳槽中的位置，避免電(diàn)泳過程中出現偏移；

 

上(shàng)海領駿自主研發的磁珠法核酸提取試劑，可(kě)以提取高(gāo)質量的核酸DNA/RNA，進行(xíng)瓊脂糖凝膠電(diàn)泳，能夠得(de)到清晰、明(míng)亮、完整的條帶，并且操作(zuò)簡單快速，整個(gè)流程基本分為(wèi)（裂解結合、洗滌、幹燥、洗脫），大(dà)多(duō)數(shù)10-30min內(nèi)即可(kě)完成。可(kě)針對血液、血清/血漿、唾液、細菌、真菌、拭子、糞便、動植物組織、中草藥、石蠟包埋組織、PCR産物、測序反應産物等樣本，分離純化高(gāo)質量基因組DNA/RNA、cfDNA、ctDNA或病毒核酸。

圖 新鮮yan葉DNA/RNA提取電(diàn)泳圖

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