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PCR常見問題分析及對策

發布時(shí)間(jiān)：

2023-06-20 10:21

PCR常見問題分析及對策

問題1：無擴增産物

現象：正對照有(yǒu)條帶，而樣品則無

原因:

1.模闆:含有(yǒu)抑制(zhì)物，含量低(dī)

2.Buffer對樣品不合适

3.引物設計(jì)不當或者發生(shēng)降解

4.反應條件：退火(huǒ)溫度太高(gāo)，延伸時(shí)間(jiān)太短(duǎn)

對策:

1.純化模闆或者使用試劑盒提取模闆DNA或加大(dà)模闆的用量

2.更換Buffer或調整濃度

3.重新設計(jì)引物（避免鏈間(jiān)二聚體(tǐ)和(hé)鏈內(nèi)二級結構）或者換一管新引物

4.降低(dī)退火(huǒ)溫度、延長延伸時(shí)間(jiān)

問題2：非特異性擴增

現象：條帶與預計(jì)的大(dà)小(xiǎo)不一緻或者非特異性擴增帶

原因：

1.引物特異性差

2.模闆或引物濃度過高(gāo)

3.酶量過多(duō)

4.Mg2+濃度偏高(gāo)

5.退火(huǒ)溫度偏低(dī)

6.循環次數(shù)過多(duō)

對策：

1.重新設計(jì)引物或者使用巢式PCR

2.适當降低(dī)模闆或引物濃度

3.适當減少(shǎo)酶量

4.降低(dī)鎂離子濃度

5.适當提高(gāo)退火(huǒ)溫度或使用二階段溫度法

6.減少(shǎo)循環次數(shù)

問題3：拖尾

現象：産物在凝膠上(shàng)呈Smear狀态。

原因：

1.模闆不純

2.Buffer不合适

3.退火(huǒ)溫度偏低(dī)

4.酶量過多(duō)

5.dNTP、Mg 2+濃度偏高(gāo)

6.循環次數(shù)過多(duō)

對策：

1.純化模闆

2.更換Buffer

3.适當提高(gāo)退火(huǒ)溫度

4.适量用酶

5.适當降低(dī)dNTP和(hé)鎂離子的濃度

6.減少(shǎo)循環次數(shù)

問題4：假陽性

現象：空(kōng)白對照出現目的擴增産物

原因：

靶序列或擴增産物

的交*污染

對策：

1.操作(zuò)時(shí)應小(xiǎo)心輕柔，防止将靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外；

2.除酶及不能耐高(gāo)溫的物質外，所有(yǒu)試劑或器(qì)材均應高(gāo)壓消毒。所用離心管及加樣槍頭等均應一次性使用。

3.各種試劑最好先進行(xíng)分裝，然後低(dī)溫貯存

PCR引物設計(jì)的黃金法則

1.引物最好在模闆cDNA的保守區(qū)內(nèi)設計(jì)。

DNA序列的保守區(qū)是通(tōng)過物種間(jiān)相似序列的比較确定的。在NCBI上(shàng)搜索不同物種的同一基因，通(tōng)過序列分析軟件（比如DNAman）比對（Alignment），各基因相同的序列就是該基因的保守區(qū)

2.引物長度一般在15~30堿基之間(jiān)。

引物長度（primer length）常用的是18-27 bp，但(dàn)不應大(dà)于38，因為(wèi)過長會(huì)導緻其延伸溫度大(dà)于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶進行(xíng)反應。

3.引物GC含量在40%~60%之間(jiān)，Tm值最好接近72℃。

GC含量（composition）過高(gāo)或過低(dī)都不利于引發反應。上(shàng)下遊引物的GC含量不能相差太大(dà)。另外，上(shàng)下遊引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。有(yǒu)效啓動溫度，一般高(gāo)于Tm值5~10℃。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估計(jì)引物的Tm值，則有(yǒu)效引物的Tm為(wèi)55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使複性條件最佳。

4.引物3′端要避開(kāi)密碼子的第3位。

如擴增編碼區(qū)域，引物3′端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發生(shēng)簡并，會(huì)影(yǐng)響擴增的特異性與效率。

5.引物3′端不能選擇A，最好選擇T。

引物3′端錯配時(shí)，不同堿基引發效率存在着很(hěn)大(dà)的差異，當末位的堿基為(wèi)A時(shí)，即使在錯配的情況下，也能有(yǒu)引發鏈的合成，而當末位鏈為(wèi)T時(shí)，錯配的引發效率大(dà)大(dà)降低(dī)，G、C錯配的引發效率介于A、T之間(jiān)，所以3′端最好選擇T。

6. 堿基要随機分布。

引物序列在模闆內(nèi)應當沒有(yǒu)相似性較高(gāo)，尤其是3’端相似性較高(gāo)的序列，否則容易導緻錯誤引發（False priming）。降低(dī)引物與模闆相似性的一種方法是，引物中四種堿基的分布最好是随機的，不要有(yǒu)聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不應超過3個(gè)連續的G或C，因這樣會(huì)使引物在GC富集序列區(qū)錯誤引發。

7. 引物自身及引物之間(jiān)不應存在互補序列。

引物自身不應存在互補序列，否則引物自身會(huì)折疊成發夾結構（Hairpin）使引物本身複性。這種二級結構會(huì)因空(kōng)間(jiān)位阻而影(yǐng)響引物與模闆的複性結合。引物自身不能有(yǒu)連續4個(gè)堿基的互補。

兩引物之間(jiān)也不應具有(yǒu)互補性，尤其應避免3′端的互補重疊以防止引物二聚體(tǐ)（Dimer與Cross dimer）的形成。引物之間(jiān)不能有(yǒu)連續4個(gè)堿基的互補。

引物二聚體(tǐ)及發夾結構如果不可(kě)避免的話(huà)，應盡量使其△G值不要過高(gāo)（應小(xiǎo)于4.5kcal/mol）。否則易導緻産生(shēng)引物二聚體(tǐ)帶，并且降低(dī)引物有(yǒu)效濃度而使PCR 反應不能正常進行(xíng)。

8. 引物5′ 端和(hé)中間(jiān)△G值應該相對較高(gāo)，而3′ 端△G值較低(dī)。

△G值是指DNA 雙鏈形成所需的自由能，它反映了雙鏈結構內(nèi)部堿基對的相對穩定性，△G值越大(dà)，則雙鏈越穩定。應當選用5′ 端和(hé)中間(jiān)△G值相對較高(gāo)，而3′端△G值較低(dī)（絕對值不超過9）的引物。引物3′ 端的△G 值過高(gāo)，容易在錯配位點形成雙鏈結構并引發DNA 聚合反應。（不同位置的△G值可(kě)以用Oligo 6軟件進行(xíng)分析）

9.引物的5′端可(kě)以修飾，而3′端不可(kě)修飾。

引物的5′ 端決定着PCR産物的長度，它對擴增特異性影(yǐng)響不大(dà)。因此，可(kě)以被修飾而不影(yǐng)響擴增的特異性。引物5′端修飾包括：加酶切位點；标記生(shēng)物素、熒光、地高(gāo)辛、Eu3+等；引入蛋白質結合DNA序列；引入點突變、插入突變、缺失突變序列；引入啓動子序列等。

引物的延伸是從3′ 端開(kāi)始的，不能進行(xíng)任何修飾。3′ 端也不能有(yǒu)形成任何二級結構可(kě)能。

10. 擴增産物的單鏈不能形成二級結構。

某些(xiē)引物無效的主要原因是擴增産物單鏈二級結構的影(yǐng)響，選擇擴增片段時(shí)最好避開(kāi)二級結構區(qū)域。用有(yǒu)關軟件（比如RNAstructure）可(kě)以預測估計(jì)mRNA的穩定二級結構，有(yǒu)助于選擇模闆。實驗表明(míng)，待擴區(qū)域自由能（△G°）小(xiǎo)于58.6l kJ/mol時(shí)，擴增往往不能成功。若不能避開(kāi)這一區(qū)域時(shí)，用7-deaza-2′-脫氧GTP取代dGTP對擴增的成功是有(yǒu)幫助的。

11. 引物應具有(yǒu)特異性。

引物設計(jì)完成以後，應對其進行(xíng)BLAST檢測。如果與其它基因不具有(yǒu)互補性，就可(kě)以進行(xíng)下一步的實驗了。

值得(de)一提的是，各種模闆的引物設計(jì)難度不一。有(yǒu)的模闆本身條件比較困難，例如GC含量偏高(gāo)或偏低(dī)，導緻找不到各種指标都十分合适的引物；用作(zuò)克隆目的的PCR，因為(wèi)産物序列相對固定，引物設計(jì)的選擇自由度較低(dī)。在這種情況隻能退而求其次，盡量去滿足條件。

做(zuò)Real Time時(shí),用于SYBR Green I法時(shí)的一對引物與一般PCR的引物,在引物設計(jì)上(shàng)所要求的參數(shù)是不同的。

引物設計(jì)的要求：

1)避免重複堿基，尤其是G.

2)Tm=58-60度。

3）GC=30-80%.

4)3'端最後5個(gè)堿基內(nèi)不能有(yǒu)多(duō)于2個(gè)的G或C.

5)正向引物與探針離得(de)越近越好，但(dàn)不能重疊。

6)PCR擴增産物長度：引物的産物大(dà)小(xiǎo)不要太大(dà)，一般在80-250bp之間(jiān)都可(kě)；80～150bp最為(wèi)合适（可(kě)以延長至300 bp）。

7)引物的退火(huǒ)溫度要高(gāo)，一般要在60度以上(shàng)；

要特别注意避免引物二聚體(tǐ)和(hé)非特異性擴增的存在。

而且引物設計(jì)時(shí)應該考慮到引物要有(yǒu)不受基因組DNA污染影(yǐng)響的能力，即引物應該跨外顯子，最好是引物能跨外顯子的接頭區(qū)，這樣可(kě)以更有(yǒu)效的不受基因組DNA污染的影(yǐng)響。

至于設計(jì)軟件，PRIMER3,PRIMER5,PRIMEREXPRESS都應該可(kě)以的。

做(zuò)染料法最關鍵的就是尋找到合适的引物和(hé)做(zuò)污染的預防工作(zuò)。對于引物，你(nǐ)要有(yǒu)從一大(dà)堆引物中挑出一兩個(gè)能用的引物的思想準備---尋找合适的引物非常不容易。

關于BLAST的作(zuò)用應該是通(tōng)過比對，發現你(nǐ)所設計(jì)的這個(gè)引物，在已經發現并在GENEBANK中公開(kāi)的不物種基因序列當中，除了和(hé)你(nǐ)的目标基因之外，還(hái)有(yǒu)沒有(yǒu)和(hé)其他物種或其他序列當中存在相同的序列，如和(hé)你(nǐ)的目标序列之外的序列相同的序列，則可(kě)能擴出其他序列的産物，那(nà)麽這個(gè)引物的特異性就很(hěn)差，從而不能用。

來(lái)源：IVD學習筆記

 

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